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污泥-废糖蜜联合发酵培养Bt 生物杀虫剂
本文考察了城市污泥与废糖蜜联合发酵培养苏云金芽孢杆菌（Bt）生物杀虫剂的可行性。作为污泥发酵的补充碳源，废糖蜜添加比例低于2.0%（质量比）时，对Bt的生长、代谢、晶体蛋白合成以及毒效有良好的促进作用，当添加比例高于2.0%时则表现出抑制作用。通过改变废糖蜜添加比例，获得污泥与废糖蜜的最佳配比：即在含固率为3%的污泥中添加1.5%的废糖蜜。此配比对Bt生长最为有利，活菌数与活芽孢数最大值可分别达到4.17×108和3.60×108CFU/ml，发酵48h后，发酵液中晶体蛋白产量约为1.96mg/ml，毒效788IU/μL，高于其他复配培养基。此外，本研究表明，晶体蛋白产量和发酵液生物毒效有显著相关性，晶体蛋白含量可作为一种简单可靠的Bt发酵性能表征指标，在Bt生产中有一定实用价值。
【关键词】城市污泥; 废糖蜜; 晶体蛋白; 杀虫毒效
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thurngiensis，简称Bt）是一类能在代谢过程中产生伴孢晶体（杀虫晶体蛋白）的革兰氏阳性细菌，其伴孢晶体蛋白对600多种害虫有杀虫活性，其制剂已被开发应用于防治农林害虫、贮藏害虫以及医学昆虫。Bt制剂具有高效低毒、环境安全、对害虫特异性强、不杀伤害虫天敌等诸多优点，是当今世界上产量最大的生物杀虫剂，占生物杀虫剂全球总销售额的90%以上。目前Bt杀虫剂主流生产工艺是液体深层发酵，主要以各种工农业产品或农副产品，如葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、黄豆粉、玉米淀粉、花生饼粉，麦麸等为原料，原料成本约占总成本的35%-59%，是生物杀虫剂难于普及的主要限制因素之一。为降低Bt生产的原料成本，提高其市场竞争力，从废弃资源再利用的角度出发，已有研究提出以城市污泥为原料发酵生产Bt生物杀虫剂。
然而，我们在研究中发现，单一污泥培养Bt，发酵水平较低，发酵液杀虫活性不高。究其原因，可能是污泥中可利用碳源不足。废糖蜜是制糖业生产过程中的副产物，含有丰富的微生物可利用碳源（还原糖占总糖量的60%-80%），目前主要用于发酵制酒精，产品附加值不高且产生的废水为高污染。本文将废糖蜜用作污泥发酵的补充碳源，通过优化污泥与废糖蜜配比来改善Bt’发酵过程（菌体增殖、芽孢形成与晶体蛋白合成），提高发酵液杀虫毒效。
1 材料与方法
1.1 菌种
苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki 130-1, 四川师范大学胡佩博士惠赠, 本实验室保藏。
1.2 供试材料
1.2.1 城市污泥
采自北京高碑店污水处理厂, 为未经消化的浓缩污泥, 理化性质见表1。采回置于4 ℃ 冰箱中保存, 待与废糖蜜复配。
1.2.2 废糖蜜
俗称桔水,采自南宁,褐色,粘稠状, 4℃ 冰箱保存。经分析, 含固率约为70%, pH = 4190, 还原糖含量562.3 g/kg , 粗蛋白15.7 g/kg。
1.3 培养基
(1)固体培养基, 即BP 培养基( g/L) : 牛肉膏510, 蛋白胨10.0, NaCl 5.0, 琼脂粉15.0, pH 7.2;
(2)液体培养基: 固体培养基成分中除去琼脂粉, 用作种子培养基;
(3)发酵培养基: 污泥与废糖蜜复配, 随废糖蜜添加比例的不同, 分为6 个处理, 编号A--F( A: 原污泥; B: 污泥+0.5% 废糖蜜; C: 污泥+ 1.0% 废糖蜜;D: 污泥+ 1.5% 废糖蜜; E: 污泥+ 2.0% 废糖蜜; F:污泥+ 2.5%废糖蜜) , 混匀后用4mol/L的NaOH和HCl 调节pH, 使灭菌后pH 在7.0 左右。
1.4 接种物
250mL 锥形瓶内盛50mL Bp液体培养基, 从斜面培养基中移取一环Bt 接种,于( 30±1) ℃和200/min往复式摇床培10h。预试验表明, 此时Bt处于对数生长期, 是接种的适宜时期。
1.5 摇瓶发酵试验
500mL 锥形瓶内盛100mL 各组合发酵培养基,移取2% ( 体积比) 上述接种物。接种后于( 30±1)℃, 200 r/min的往复式摇床培养48h, 每隔3h 移取发酵液3mL, 测定pH、活菌数及活芽孢数。至48 h发酵完成时用25%磷酸调节pH 至5.0-5.5, 待测晶体蛋白含量及杀虫毒效。
1.6 分析方法
活菌数( VC) 与活芽孢数( VS) : 采用无菌操作,将发酵液进行梯度稀释, 取适宜稀释度的菌液涂布平板, 于30℃恒温培养16~-18h 后计活菌数; 对于活芽孢数, 需将适宜稀释度的菌液于80℃水浴处理15min, 然后进行涂布培养计数, 每平板菌数在30-300 CFU( Colony forming unit, 菌落形成单位) 内有效。晶体蛋白含量测定: 按照《中华人民共和国国家标准》GB/T 19567.3-2004 中的SDS-PAGE 洗脱比色法测定晶体蛋白含量, 以130000 Da作为测定条带。
杀虫毒效生物测定: 根据国家标准《苏云金芽孢杆菌悬浮剂》GB/T 19567.2-2004 对产品毒效进行生物测定。以小菜蛾( Plutella xylostrella ) 为标准供试虫种, 以湖北省农业科学院生物农药工程中心提供的CS-1991 (H3a3b) 为标准对照( 标准品毒力效价:55 000 IU/mg) , 按照标准化程序进行毒力效价测定。数据采用SPSS 统计软件进行ANOVA 方差分析, 两两比较采用t 检验。
2 结果与讨论
2.1 生长代谢状况
Bt 是一类化能有机营养型细菌, 只能利用有机含碳化合物作为碳源和能源。自然界的含碳化合物种类繁多, 并非都能被Bt 利用, 常用作碳源的主要是糖类。城市污泥中总碳含量高达30%-40% ,但易为Bt 同化利用的还原糖、淀粉等在碳源中所占比例很低, 不超过污泥干重的3%。因此以污泥作为培养基质时, Bt 往往因碳素营养不足而过早进入稳定期 , 导致发酵液中活菌数较低, 限制了后续的芽孢形成与晶体蛋白合成, 从而降低了发酵液的生物毒效。针对污泥可利用碳源不足, 本研究考察了污泥-废糖蜜联合发酵, 通过逐步提高废糖蜜添加比例, 形成了一系列复配培养基。摇瓶发酵48h, 过程中VC、VS 与pH 的动态变化如图1 所示。
观察图1 , 当采用含固率为3% 的污泥作为唯一培养基时, 菌体生长的指数期较短, 活菌数增幅较小, 发酵6hVC 出现第一次峰值, 仅有6.33×107CFU/mL , 远远低于同期污泥-废糖蜜联合发酵的结果, 而后进入芽孢形成期, 受指数期菌体大量增殖的影响, 此时培养基中溶解氧处于较低水平, 菌体的稳定性及菌落形成能力较差 ,VC 值下降明显,尽管发酵后期迅速上升, 活菌数还是受到一定影响,VC 最大值出现在36h, 为2.57 ×108CFU/mL。而从VC 曲线比较可以看出, 在0%-2.5% 的废糖蜜添加比例范围内, 污泥-废糖蜜联合发酵明显优于污泥本身, 且随着废糖蜜比例的提高, 指数期持续时间加长, 活菌数也明显增加。例如, 添加2.5% 废糖蜜的培养基发酵9h 时, VC 值可达5.46 ×108CFU/mL , 是同期污泥单独发酵的9 倍。另外, 废糖蜜的添加也改善了芽孢形成初期VC 值回落的现象, 有利于缓解曲线的/ 双对数现象。添加1.5% 废糖蜜的培养基VC 值仅有轻度回落, 且持续时间较短, 说明适量增加污泥中的还原糖含量有利于提高芽孢形成期菌体的稳定性。至发酵终点( 48h) , 最高VC 值出现在F 处理( 污泥+ 2.5% 废糖蜜) , 约为2.95 ×108CFU/mL, 比不加糖蜜的单一污泥发酵( 1.80×108CFU/mL) 高出63.9%。
进一步观察图1( b) 可以发现, 当废糖蜜添加比例≤2.0% 时, 芽孢的形成在12-18 h 最旺盛, 发酵24 h 时抗热性芽孢已基本成熟, 此时用晶体与芽孢区别染色法可明显观察到菌体的一端为染成蓝色的晶体, 另一端是无色透明的芽孢。当糖蜜添加比例> 2.0%时, 由于碳素含量过高, 芽孢的形成明显延滞, 48 h 才能观察到成熟的芽孢和晶体, 并且数量只有9.0×107CFU/mL 。在整个发酵过程中,VS 最大值出现在添加1.5% 废糖蜜的培养基发酵24 h 时, 约为3.6 ×108CFU/mL。
图1( c) 显示了废糖蜜添加比例对Bt 发酵液pH变化的影响。随废糖蜜添加比例的提高, 糖代谢引起的pH 下降程度明显加强, 持续时间也逐渐增长。特别是废糖蜜添加比例为215% 的处理, pH 可持续降至最低值6.10, 培养基长期处于低pH 水平, 可能对菌体代谢产生负面影响, 致使芽孢形成延迟, 发酵周期延长。综上所述, 作为污泥发酵培养Bt 的补充碳源,废糖蜜的添加比例为1.5% ( 质量比) 时, 对Bt 生长代谢最为有利, 发酵过程中活菌数与活芽孢数最大值可分别达到4.17×108和3.603.6 ×108CFU/mL。
2.2 晶体蛋白产量
Bt 的主要杀虫活性物质是伴孢晶体( 晶体蛋白, 简称Cry) 。在昆虫中肠碱性条件下, Cry 被降解为毒性蛋白肽, 破坏中肠上皮细胞, 同时芽孢侵入增殖, 导致昆虫痉挛或败血症而死 。Cry 的合成受培养基组成及培养条件的影响显著。对上述各复配培养基48 h 的发酵终产物进行SDS-PAGE 电泳, 并与高分子量蛋白Marker 进行对照( 如图2 所示) , 经计算该菌株的晶体蛋白分子量在约为130000 Da, 是对鳞翅目昆虫有毒效的特征蛋白。图2 同时也直观地显示了不同添加比例的废糖蜜对发酵液中晶体蛋白含量的影响, 当废糖蜜添加比例< 210%时, 随着添加比例的提高, 蛋白带变宽变深,说明适量添加碳源有利于晶体蛋白合成与积累; 继续添加废糖蜜( > 2.0% ) 时, 晶体蛋白带明显变浅, 说明过多的碳源抑制了晶体蛋白合成。
进一步割胶比色, 并将吸光值代入同步操作的标准晶体蛋白回归方程( y = 124.224x + 4.12924,R = 0.997, 其中x-ABS, y-Cry/mg/mL) , 得到不同复配培养基发酵终点的晶体蛋白含量, 如图3 所示。A-F 6 组间的方差分析结果显示, 除C 与E 两组间蛋白含量无显著差异外, 其余各组两两间均存在显著性差异( P < 0.01) 。这说明适当添加废糖蜜可显著提高晶体蛋白产量, 添加1.5% 废糖蜜时发酵液Cry 浓度最高, 达1196mg/mL。而继续提高废糖蜜添加比例至215% 时, Cry 产量却迅速降至0.28mg/mL, 推断这是由于过量废糖蜜导致发酵周期延长, 芽孢不易形成, 同时晶体蛋白的合成受到延滞或抑制。
2.3 生物毒力效价
实验以2龄末小菜蛾幼虫作为试虫, 接虫感染48h 后发现, Bt 发酵液对小菜蛾有明显杀虫活性, 感染Bt 而死亡的昆虫可观察到全身变黑、腐烂并萎缩, 死亡率与晶体蛋白浓度梯度显著相关, 具体数据如表2 所示。从表2 中可以看出, 除添加2.5%废糖蜜的培养基外, 其他复配培养基LC50都在1μL/mL以下, 显著低于单一污泥发酵的培养基, 且废糖蜜最适宜的添加比例在1.0%-2.0%之间。通过与标准品进行代换, 得出48 h 各发酵液的毒效(Tx ) , 从中可以看出随废糖蜜添加比例的提高, 毒效呈阶梯上升, 添加115%废糖蜜的培养基毒效最高( 为788IU/μL) 。而继续提高废糖蜜添加比例毒效反而显著下降, 与晶体蛋白含量反映的趋势相同。
2.4 晶体蛋白含量与生物毒效的相关性分析
生物毒效是表征发酵性能的最有效指针。但它的测定费时费力, 因此在Bt 生产中往往期望能用简单快速的方法( 例如芽孢数量或晶体蛋白含量) 来监控发酵过程与产品质量。事实上, 发酵液最终毒效是发酵过程中营养体增殖、芽孢形成及晶体蛋白合成的综合反映。正常生长的营养体是形成芽孢的基础, 而伴孢晶体的合成以芽孢形成为前提。图4 分别反映了各培养基发酵48 h 时VS 与Tx、Cry 产量与Tx 的相关性。SPSS 分析结果显示, VS 与Tx 的相关性不显著( R = 01795, n = 6, P > 0105) ; 而Cry 产量与Tx 极显著相关( R = 01971, n= 6, P < 0.01) , 说明芽孢数量不能作为表征发酵液生物毒效的定量依据, 而晶体蛋白含量可用作表征发酵性能的简单、可靠的方法, 大大缩短生物毒效测定周期与费用, 在Bt 生产中有一定实用价值。
3 结 论
(1) 废糖蜜是污泥发酵培养Bt 的良好补充碳源。适量添加废糖蜜( ≤2.0% ) 可以改善发酵过程中Bt 生长代谢状况( 包括菌数增长、芽孢形成与晶体蛋白合成) 与发酵液的生物毒效; 但当废糖蜜添加比例> 210%时明显抑制发酵过程。
( 2) 以含固率3%的污泥为对照, 通过改变废糖蜜添加比例得出污泥-废糖蜜联合发酵培养Bt 的最佳复配比例为: 污泥+ 1.5%废糖蜜, 此时Bt 生长最旺盛, 活菌落数与活芽孢数最大值可分别达到4.17×108CFU/mL和3.60×108CFU/mL , 晶体蛋白产量与杀虫毒效最高, 是污泥单独发酵的3-4 倍。
( 3) 晶体蛋白产量与发酵液生物毒效有极显著相关性, 可用作表征Bt 发酵性能的简单、实用、可靠的指标。
(4) 本研究通过污泥-废糖蜜联合发酵生产Bt生物杀虫剂, 为两种有机废弃物的资源高值化利用提供了一条新的有用途径。（本文搜集整理于网络，如有侵权之处，请联系我们删除。）