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利用甘蔗糖蜜生产饲料酵母发酵条件的研究
以甘蔗糖蜜为碳源发酵生产生物量饲料酵母，通过单因素正交试验设计，确定优化的培养条件为：温度28℃，pH5.0.装液量200ml/500ml，摇床转速180r/min，培养时间84h。在优化的培养条件下酵母菌株的总蛋白质含量可达到6.01g/L。
关键词:甘蔗糖蜜; 饲料酵母; 正交试验设计; 发酵条件
近年来，许多国家已将微生物发酵技术逐步应用到饲料工业生产上。饲料酵母是利用工农业废弃物及副产品下脚料采用酵母菌株发酵技术生产的一种蛋白质饲料，是单细胞蛋白质的主要产品，其蛋白质含量为40%-60%，并含有多种动物必须氨基酸和维生素，是营养价值近于鱼粉的优质蛋白质饲料。甘蔗糖蜜是甘蔗制糖的主要副产物，总糖分在50%左右，且含有维生素和微量元素等多种可利用成分。甘蔗糖蜜含有丰富的适宜酵母生长的营养成分，是发酵生产酵母的良好原料。利用甘蔗糖蜜生产蛋白质饲料酵母极具开发潜力，可减少糖蜜的污染，具有重要意义。本实验通过单因素和正交试验设计，研究以甘蔗糖蜜为碳源发酵生产高生物蛋白质饲料酵母的培养条件优化组合，为工业生产蛋白质饲料酵母提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株。啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)S906, 前期试验初筛获得, 本实验室保存。
1.1.2 材料与试剂。麦芽汁参照诸葛健( 1997) 麦芽处理方法进行配制处理; 甘蔗糖蜜, 参照酸化水解法进行糖蜜预处理, 试剂均为国产分析纯。
1.1.3 主要仪器。BACKMANJ2- 21 高速冷冻离心机( 美国Backman 公司) ; YP1200 型电子天平( 上海精科实业有限公司) ; 糖用锤度计( 浙江余姚仪表二厂) ; SPX- 250 型生化培养箱( 上海跃进医疗仪器厂) ; HQL300A 柜式恒温冷冻摇床( 中国科学院武汉科学仪器厂) ; 101- 2- BS 电热恒温鼓风干燥箱( 上海跃进医疗器械厂) ; 320 pH Meter (Mettlertoledo 公司) ; UV- 1601 紫外分光光度计( 日本SHIMADZU 公司) 。
1.1.4 培养基。麦芽汁斜面培养基: 10 °Bx 麦芽汁, 琼脂2 %。种子培养基: 10 °Bx 糖蜜, 硫酸铵0.1 %, 磷酸二氢钾0.1 %, 七水硫酸镁0.04 %, pH5。摇瓶发酵培养基: 同种子培养基, pH 5.5。
1.2 方法
1.2.1 菌株活化。无菌条件下接一环保藏菌种至麦芽汁斜面培养基, 28 ℃培养48 h 复苏菌种。
1.2.2 种子扩大培养。取一环活化后的斜面菌种转接到装液量20 mL/100 mL 的种子培养基,28℃、180 r/min 培养24 h。
1.2.3 摇瓶发酵。发酵培养基装液量100 mL/500mL 三角瓶, 接种量10 %, 28 ℃、180 r/min 摇床培养48 h。
1.2.4 细胞生物量测定。发酵液6000 r/min 离心15 min, 蒸馏水洗涤3 次, 收集菌体, 80 ℃烘干至恒重, 称量并记录数值。
1.2.5 细胞蛋白质含量测定。酵母细胞中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法进行测定。
1.2.6 总蛋白质得率。不同菌株的生物量和细胞蛋白质含量各不相同, 有的菌株生物量低而蛋白质含量高, 而有的菌株生物量高蛋白质含量却不理想, 综合考虑两个因素, 以单位容积的发酵液收获的菌体全部蛋白质含量( 总蛋白质得率) 为最终分析指标。总蛋白质得率( g/L) =细胞生物量( g/L) ×细胞蛋白质含量(%)。
1.2.7 单因素试验。选取糖蜜浓度、氮源、pH、温度、接种量、摇床转速、装液量、培养时间等因素研究其对菌株总蛋白质得率的影响。
1.2.8 正交试验。根据单因素试验结果, 选取对生产蛋白质饲料酵母发酵条件影响较大的显著因素设计正交试验, 研究发酵条件的最佳优化组合。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 糖蜜酸化水解液糖度对总蛋白质得率的影响。见图1。
由图1可知, 当糖度10°Bx 时, 总蛋白质得率最高, 因此后继试验培养基糖度为10 °Bx。
2.1.2 最佳氮源选择。
在培养液中分别添加一定比例的硫酸铵、氯化铵、尿素、蛋白胨、酵母膏、草酸铵, 培养后收集菌体, 测定细胞生物量及蛋白质含量后计算总蛋白质得率, 结果见图2，由图可知, 以蛋白胨作为氮源时总蛋白质得率最高, 后继试验均以蛋白胨作为氮源。
2.1.3 蛋白胨浓度对总蛋白质得率的影响。
在确定碳源与氮源的基础上, 试验进一步研究了不同浓度蛋白胨对菌株S906 细胞生物量和蛋白质含量的影响, 结果见图3。由图3 可知, 过高的蛋白胨浓度对细胞生物量及蛋白质含量有一定的抑制作用, 蛋白胨浓度为7 g/L 时, 菌体细胞生物量和蛋白质含量最高。
2.1.4 装液量对总蛋白质得率的影响。见图4。
由图4 可知, 发酵的最佳装液量为150 mL/500 mL, 此时总蛋白质得率最高。
2.1.5 pH 对总蛋白质得率的影响。
酵母菌适宜的pH 范围是微酸性的, 为了确定菌株总蛋白质得率的最佳pH 值, 选择了起始pH 值低于7 的发酵培养液进行试验, 结果见图5。由图5 可知, 在发酵培养液起始pH 值为5 时酵母菌株的总蛋白质得率最高。
2.1.6 摇床转速对总蛋白质得率的影响。见图6。
由图6 可知, 在一定范围内, 随着的摇床转速增大总蛋白质得率也随之增加, 当转速为200 r/min 时总蛋白质得率达最高值, 此后又呈下降趋势, 后继试验摇床转速为200 r/min。
2.1.7 温度对总蛋白质得率的影响。见图7。
由图7 可知, 温度对总蛋白质得率的影响较为显著, 当温度为28 ℃时总蛋白质得率最高。
2.1.8 接种量对总蛋白质得率的影响。见图8。
由图8 可知, 以不同接种量把种子培养液接入发酵培养液, 当接种量为10 %时总蛋白质得率
最高。
2.1.9 培养时间对总蛋白质得率的影响。见图9。
由图9 可知, 随着培养时间延长, 总蛋白质得率逐渐增加, 72 h 后达最大值, 此后呈现下降趋势, 这可能与培养液中养料耗尽, 细胞发生自溶有关。
2.2 正交试验
根据单因素试验结果, 选取培养温度、发酵液pH 值、转速、装液量及培养时间5个显著影响因素设计正交试验, 采用L16( 45)的正交设计( 见表1) , 结果见表2。
由表2 可知, RA>RB>RE>RD>RC, 即温度对总蛋白质得率的影响最为显著, 然后依次为pH、发酵时间、装液量, 最不显著的因子为摇床转速。其中菌株S906 的最佳发酵条件组合为A2B2C2D3E4,即温度28 ℃, pH 5.0, 摇床转速180 r/min, 装液量200 mL/500 mL, 培养时间84 h。由于在试验设计表没有符合此发酵条件的方案, 所以按照上述得出的最佳发酵条件做追加试验, 试验重复3 次, 并与初始培养条件下菌株的总蛋白质得率进行对比。试验结果表明, 初始培养条件和优化培养条下菌株的总蛋白质得率分别为4.19 g/L 和6.01 g/L,比优化前提高43.4 %。
3 结 论
本试验以初筛所得高蛋白质得率啤酒酵母菌株S906 作为初发菌株, 以甘蔗糖蜜为唯一碳源, 发酵培养饲料酵母。通过单因素试验和正交试验设计, 得出发酵培养蛋白质饲料酵母的最佳培养基组合为: 糖蜜浓度10°Bx, 氮源为蛋白胨, 其最适浓度为7 g/L, 培养基初始pH 5.0; 最佳发酵条件为: 温度28 ℃, 摇床转速180 r/min, 接种量10 %, 装液量200 mL/500 mL, 培养时间84 h, 在此最优培养条件下菌株S906 总蛋白质得率达到6.01 g/L。试验结果表明， 甘蔗糖蜜是发酵培养蛋白质饲料酵母的良好原料。（本文搜集整理于网络，如有侵权之处，请联系我们删除。）