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L_亮氨酸发酵用糖蜜预处理方法研究
分析了糖蜜中影响发酵产生L-亮氨酸的不利因素。为除去影响发酵产生L-亮氨酸的各种杂质，重点研究了几种糖蜜预处理方法，对预处理前后糖蜜中各种糖分和钙离子含量进行了分析确定。并将预处理后糖蜜进行摇瓶发酵，根据菌种生长情况和发酵产生L-亮氨酸的含量，最终确定硫酸法为最佳糖蜜预处理方法。
关键词：甘蔗糖蜜 预处理 分析 测定 发酵 L-亮氨酸发酵：
在发酵工业上所谓的糖蜜，主要是指制糖工业上不能再用于煮制糖品的废糖蜜（waste molasses）。甘蔗糖蜜含糖量高，是很好的发酵原料。目前国内外常以糖蜜为原料发酵生产酒精、谷氨酸、酵母、抗生素和饲料等。
广西是全国甘蔗生产基地，甘蔗糖蜜的资源丰富，价格低廉，是发酵生产L-亮氨酸的很好的碳源。但糖蜜不经处理直接稀释发酵时有以下原因影响发酵：①因其中含有剩余金属离子和营养物质能促使菌体过渡生长，阻碍产酸；②含有过剩生物素，需要抑制其作用的添加物，这就比淀粉水解发酵生产L-亮氨酸的工艺复杂；③糖蜜含有黑褐色色素，影响成品色泽；④含有胶体物质，粘度大，致使发酵中泡沫过多，对于提取也带来困难；⑤含有较多的钙质物质，这对于L-亮氨酸的提取很不利，以上种种原因致使L-亮氨酸产量往往很低。因此，对远糖蜜进行预处理对发酵生产L-亮氨酸具有重要意义。
1 材料方法
1.1材料
蔗糖糖蜜：含糖量50%左右，锤度约为54°Bx；黄色短杆菌（Brevibact eriu mflavum）L-422。
1.1.1主要试剂
（1）化学试剂：所有试剂均为国产AR级。0.85%生理盐水：0.85gNaCl溶于100g蒸馏水中。6mol/L烟酸：取50ml浓盐酸倒入50ml蒸馏水中，混匀即可。20%NaOH溶液：20gNaOH溶于80g蒸馏水中。活性炭。
（2）活化斜面（g/L）：葡萄糖20，牛肉膏5，蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 2.5，琼脂20；灭菌条件：115℃存放25min；pH为7.7.
1.1.2主要仪器设备
SBA-40C型葡萄糖-谷氨酸分析仪；高速台式离心机；微量可调取样器；HWY-2112型落地式双层全温度恒温调速培养摇床；PHS-25A型数字酸度计；90L，628B-2型立式压力蒸汽消毒器；漩涡混合器；LRH-250-Ⅱ微电脑控制生化培养箱。
1.2实验方法
1.2.1分析方法
（1）菌种生长测定（吸光度法）：用可调微量移液器吸取0.5ml菌液于小离心管中，在8000rpm条件下离心2min，弃上清液留沉淀菌种，加蒸馏水震荡悬浮，移入10ml比色管中，加水定量至10ml，震荡均匀后用754-紫外-可见分光光度计测定其在波长为620nm下的吸光度（OD值）。
（2）残糖（葡萄糖）的测定:吸取发酵液0.5ml离心后，取上清液0.1ml移入10ml比色管中后，加蒸馏水定量至10ml刻度线，摇匀后用SBA-40C型葡萄糖-谷氨酸分析仪测定其残糖即葡萄糖含量。
（3）L-亮氨酸及L-缬氨酸的测定：采用纸色谱-色斑洗脱比色法测定。
（4）糖蜜中各种糖分的测定：采用斐林试剂法测定。
（5）钙离子测定：采用EDTA法测定。
（6）酸度的测定：数字酸度计测定。
（7）锤度的测定：用锤度计测定。
1.2.2处理方糖蜜预法
（1）澄清法：用乙酸锌-亚铁氰化钾溶液做澄清剂，在50-75ml样品液中加入乙酸锌溶液[21.9gZn（CH3COO）2·2H2O/L]和亚铁氰化钾（10.6%）各5ml，静置沉降，待澄清剂沉淀完全，再用3000rpm离心机分离5min，取上清液继续处理。澄清法为糖蜜预处理的第一步，然后用下面的5种处理方法进一步对糖蜜预处理。用处理后的糖蜜作为碳源，用以摇瓶发酵。
（2）硫酸处理法：糖蜜加水，质量比1：1，再加硫酸，调pH至2.0，于95-100℃加热20min，使胶体分离，并促使蔗糖转化，也可以在此时驱除可能存在的有碍于菌体的亚硝酸，然后用14%石灰乳中和处理。由于生成大量的石膏，以及钙离子的置换作用，可除去大量的钾、钠等金属元素，从而得到澄清糖液。
（3）石灰处理法：糖蜜加水，质量比1：1，加15%新鲜石灰乳，调节pH8-pH9，加热至100℃，煮沸30min，使胶体破坏，然后以硫酸中和，静置澄清数小时，得到澄清透明的糖液。
（4）活性炭法：糖蜜经1：1加水稀释后，经颗粒活性炭吸附处理，过滤，滤液供试验。
（5）磷酸处理法：糖蜜经1：1水稀释后，加热煮沸，过滤，滤液中加浓磷酸调pH2.0-pH3.0，静置澄清，过滤，滤液加入新配制的石灰乳调至pH6.0左右，65℃-7-℃保温30min，同时加滤液重量的0.8%活性炭，过滤，滤液供试验。
（6）煮沸处理法：糖蜜经过澄清处理后，加热煮沸20min，4000rpm离心5min，取上清液供试验。
1.2.3摇瓶发酵方法
（1）发酵前准备 分别用硫酸法、石灰法、磷酸发、煮沸法、活性炭预处理糖蜜，测定原糖蜜及预处理后各种糖液中的总糖含量，分别取50g至500ml锥形瓶中（调总糖含量至10%即50g糖蜜溶液中含有5g总糖）、称取0.85gNaCl配成0.85%的生理盐水，再与6mol/L HCl、20%的NaOH和预处理后的6种糖液分别用高温灭菌锅控温至115℃，灭菌25min。
（2）菌种活化 取1支冷藏于4℃冰箱中的L-亮氨酸高产斜面保藏菌种和10支活化斜面培养基于28℃培养箱中升温至室温。在无菌室里，将已活化的菌种划线接种到活化斜面培养基上，然后放到28℃的培养箱中恒温培养20-24h。
（3）摇瓶发酵 在无菌室里，用6mol/L的NaOH调预处理后各种糖液中的pH值至7.2-7.5.再用已灭菌的生理盐水冲洗斜面培养基上的菌种（每支培养基用1ml生理盐水），洗下的菌液混匀后，预处理后的6种糖液各加1ml菌液，摇匀取样，九层纱布封口，置摇床开始摇瓶发酵（摇床控制在T=28℃，转速240rpm），发酵至菌种对数生长中后期。
2结果与讨论
2.1糖蜜预处理前后主要成分含量的变化
采用1.1.2中的方法对糖蜜进行预处理，预处理前后糖蜜中的总糖、葡萄糖及钙离子含量如表1.
关键词：甘蔗糖蜜 预处理 分析 测定 发酵 L-亮氨酸发酵：
在发酵工业上所谓的糖蜜，主要是指制糖工业上不能再用于煮制糖品的废糖蜜（waste molasses）。甘蔗糖蜜含糖量高，是很好的发酵原料。目前国内外常以糖蜜为原料发酵生产酒精、谷氨酸、酵母、抗生素和饲料等。
广西是全国甘蔗生产基地，甘蔗糖蜜的资源丰富，价格低廉，是发酵生产L-亮氨酸的很好的碳源。但糖蜜不经处理直接稀释发酵时有以下原因影响发酵：①因其中含有剩余金属离子和营养物质能促使菌体过渡生长，阻碍产酸；②含有过剩生物素，需要抑制其作用的添加物，这就比淀粉水解发酵生产L-亮氨酸的工艺复杂；③糖蜜含有黑褐色色素，影响成品色泽；④含有胶体物质，粘度大，致使发酵中泡沫过多，对于提取也带来困难；⑤含有较多的钙质物质，这对于L-亮氨酸的提取很不利，以上种种原因致使L-亮氨酸产量往往很低。因此，对远糖蜜进行预处理对发酵生产L-亮氨酸具有重要意义。
1 材料方法
1.1材料
蔗糖糖蜜：含糖量50%左右，锤度约为54°Bx；黄色短杆菌（Brevibact eriu mflavum）L-422。
1.1.1主要试剂
（1）化学试剂：所有试剂均为国产AR级。0.85%生理盐水：0.85gNaCl溶于100g蒸馏水中。6mol/L烟酸：取50ml浓盐酸倒入50ml蒸馏水中，混匀即可。20%NaOH溶液：20gNaOH溶于80g蒸馏水中。活性炭。
（2）活化斜面（g/L）：葡萄糖20，牛肉膏5，蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 2.5，琼脂20；灭菌条件：115℃存放25min；pH为7.7.
1.1.2主要仪器设备
SBA-40C型葡萄糖-谷氨酸分析仪；高速台式离心机；微量可调取样器；HWY-2112型落地式双层全温度恒温调速培养摇床；PHS-25A型数字酸度计；90L，628B-2型立式压力蒸汽消毒器；漩涡混合器；LRH-250-Ⅱ微电脑控制生化培养箱。
1.2实验方法
1.2.1分析方法
（1）菌种生长测定（吸光度法）：用可调微量移液器吸取0.5ml菌液于小离心管中，在8000rpm条件下离心2min，弃上清液留沉淀菌种，加蒸馏水震荡悬浮，移入10ml比色管中，加水定量至10ml，震荡均匀后用754-紫外-可见分光光度计测定其在波长为620nm下的吸光度（OD值）。
（2）残糖（葡萄糖）的测定:吸取发酵液0.5ml离心后，取上清液0.1ml移入10ml比色管中后，加蒸馏水定量至10ml刻度线，摇匀后用SBA-40C型葡萄糖-谷氨酸分析仪测定其残糖即葡萄糖含量。
（3）L-亮氨酸及L-缬氨酸的测定：采用纸色谱-色斑洗脱比色法测定。
（4）糖蜜中各种糖分的测定：采用斐林试剂法测定。
（5）钙离子测定：采用EDTA法测定。
（6）酸度的测定：数字酸度计测定。
（7）锤度的测定：用锤度计测定。
1.2.2处理方糖蜜预法
（1）澄清法：用乙酸锌-亚铁氰化钾溶液做澄清剂，在50-75ml样品液中加入乙酸锌溶液[21.9gZn（CH3COO）2·2H2O/L]和亚铁氰化钾（10.6%）各5ml，静置沉降，待澄清剂沉淀完全，再用3000rpm离心机分离5min，取上清液继续处理。澄清法为糖蜜预处理的第一步，然后用下面的5种处理方法进一步对糖蜜预处理。用处理后的糖蜜作为碳源，用以摇瓶发酵。
（2）硫酸处理法：糖蜜加水，质量比1：1，再加硫酸，调pH至2.0，于95-100℃加热20min，使胶体分离，并促使蔗糖转化，也可以在此时驱除可能存在的有碍于菌体的亚硝酸，然后用14%石灰乳中和处理。由于生成大量的石膏，以及钙离子的置换作用，可除去大量的钾、钠等金属元素，从而得到澄清糖液。
（3）石灰处理法：糖蜜加水，质量比1：1，加15%新鲜石灰乳，调节pH8-pH9，加热至100℃，煮沸30min，使胶体破坏，然后以硫酸中和，静置澄清数小时，得到澄清透明的糖液。
（4）活性炭法：糖蜜经1：1加水稀释后，经颗粒活性炭吸附处理，过滤，滤液供试验。
（5）磷酸处理法：糖蜜经1：1水稀释后，加热煮沸，过滤，滤液中加浓磷酸调pH2.0-pH3.0，静置澄清，过滤，滤液加入新配制的石灰乳调至pH6.0左右，65℃-7-℃保温30min，同时加滤液重量的0.8%活性炭，过滤，滤液供试验。
（6）煮沸处理法：糖蜜经过澄清处理后，加热煮沸20min，4000rpm离心5min，取上清液供试验。
1.2.3摇瓶发酵方法
（1）发酵前准备 分别用硫酸法、石灰法、磷酸发、煮沸法、活性炭预处理糖蜜，测定原糖蜜及预处理后各种糖液中的总糖含量，分别取50g至500ml锥形瓶中（调总糖含量至10%即50g糖蜜溶液中含有5g总糖）、称取0.85gNaCl配成0.85%的生理盐水，再与6mol/L HCl、20%的NaOH和预处理后的6种糖液分别用高温灭菌锅控温至115℃，灭菌25min。
（2）菌种活化 取1支冷藏于4℃冰箱中的L-亮氨酸高产斜面保藏菌种和10支活化斜面培养基于28℃培养箱中升温至室温。在无菌室里，将已活化的菌种划线接种到活化斜面培养基上，然后放到28℃的培养箱中恒温培养20-24h。
（3）摇瓶发酵 在无菌室里，用6mol/L的NaOH调预处理后各种糖液中的pH值至7.2-7.5.再用已灭菌的生理盐水冲洗斜面培养基上的菌种（每支培养基用1ml生理盐水），洗下的菌液混匀后，预处理后的6种糖液各加1ml菌液，摇匀取样，九层纱布封口，置摇床开始摇瓶发酵（摇床控制在T=28℃，转速240rpm），发酵至菌种对数生长中后期。
2结果与讨论
2.1糖蜜预处理前后主要成分含量的变化
采用1.1.2中的方法对糖蜜进行预处理，预处理前后糖蜜中的总糖、葡萄糖及钙离子含量如表1.
实验结果显示：
（1）用硫酸法处理糖蜜，由于调节pH为2.0于98℃加热20min，可以使可溶性的灰分和胶体分解，并促使蔗糖转化为单糖，因此可以直接被菌体利用的碳源-葡萄糖含量比处理前增大很多，同时也可以在此时驱除可能存在的有碍于菌体生长的亚硝酸，然后用15%的石灰乳中和处理，由于生成大量的石膏以及钙离子的置换作用可除去大量的钾、钠等金属元素，并得到澄清糖液，但由表1可以看出葡萄糖的损失量大。
（2）用石灰法处理糖蜜，由于加入石灰乳后于100℃加热30min，可以使大量胶体物质分解沉降，加热后用硫酸中和处理，由于生成大量石膏以及钙离子的离子置换作用，可以除去大量的钾。钠等元素，并得到澄清糖液，但由表1可以看出葡萄糖的损失量大。
（3）用煮沸法处理糖蜜，不加任何药品，在煮沸状态下保持20min，可以使不溶性胶体和灰分沉淀，同时也使一些固体杂质沉淀。
（4）活性炭法处理糖蜜，加入活性炭后于60℃水浴中加热，可以除掉糖蜜中大量的生物素，同时也可以使一些胶体物质沉淀，使糖蜜变得澄清，但由表1可以看出，活性炭在除去生物素和胶体物质的同时，也因为吸附作用使大量的可以直接被菌种利用的碳源-葡萄糖损失。
（5）磷酸法处理糖蜜，开始加热到100℃可以使部分不溶性胶体和灰分沉降，加入浓磷酸后再用15%的石灰乳调节pH至6.0，则生成大量的磷酸钙沉淀，再加入0.8%（重量比）的活性炭于水浴中保温，既可以出去大量的胶体和灰分，又可以脱除部分生物素。此法除杂质虽然比较彻底，但同时也损失了大量的糖分。
2.2糖蜜预处理前后主要成分含量的变化
将不同预处理方法处理后的糖蜜作为碳源，调完总糖后直接上摇床，进行摇瓶发酵。在发酵过程中定时取样，测糖蜜发酵液中的OD值和残糖量。根据数据做OD值与摇瓶时间和残糖（即葡萄糖）量与摇瓶时间的关系曲线，借此考察糖蜜预处理方法对L-亮氨酸菌种生长代谢的影响。
发酵液OD值与L-亮氨酸菌种的生长代谢呈正比关系，所以从OD值的大小即可知道其菌种生长情况。在摇瓶发酵过程中，发酵液OD值即菌种生长趋势与摇瓶时间呈对数增长形式；而发酵液中糖的消耗曲线总体来说，基本上是随着菌体生长速度的增加而呈逐渐减小的趋势。
在摇瓶发酵初期，菌种消耗葡萄糖量较少，生长缓慢，导致OD值增加也较小，而发酵液中的残糖量较大，变化也较小；发酵中期，菌种开始大量消耗葡萄糖，生长很快，导致OD值急剧上升，残糖量却逐渐减小；发酵后期，菌种差不多停止生长，不再消耗葡萄糖，而OD值在达到最大值后则慢慢趋于平缓，残糖量不再发生变化。
2.3预处理后糖蜜对菌体生长与发酵产酸的影响。
在发酵培养基中分别添加经硫酸法、磷酸发、煮沸法、活性炭法、石灰法处理过的糖蜜作为碳源，糖蜜的加入量以加入发酵培养基后总糖浓度的10%计算。由表1可知，糖蜜中含有足够量的钙离子，因此在发酵培养基中不需加入CaCO3.不同糖蜜处理方法对发酵产酸的影响，结果见图1.
（1）用硫酸法处理糖蜜，由于调节pH为2.0于98℃加热20min，可以使可溶性的灰分和胶体分解，并促使蔗糖转化为单糖，因此可以直接被菌体利用的碳源-葡萄糖含量比处理前增大很多，同时也可以在此时驱除可能存在的有碍于菌体生长的亚硝酸，然后用15%的石灰乳中和处理，由于生成大量的石膏以及钙离子的置换作用可除去大量的钾、钠等金属元素，并得到澄清糖液，但由表1可以看出葡萄糖的损失量大。
（2）用石灰法处理糖蜜，由于加入石灰乳后于100℃加热30min，可以使大量胶体物质分解沉降，加热后用硫酸中和处理，由于生成大量石膏以及钙离子的离子置换作用，可以除去大量的钾。钠等元素，并得到澄清糖液，但由表1可以看出葡萄糖的损失量大。
（3）用煮沸法处理糖蜜，不加任何药品，在煮沸状态下保持20min，可以使不溶性胶体和灰分沉淀，同时也使一些固体杂质沉淀。
（4）活性炭法处理糖蜜，加入活性炭后于60℃水浴中加热，可以除掉糖蜜中大量的生物素，同时也可以使一些胶体物质沉淀，使糖蜜变得澄清，但由表1可以看出，活性炭在除去生物素和胶体物质的同时，也因为吸附作用使大量的可以直接被菌种利用的碳源-葡萄糖损失。
（5）磷酸法处理糖蜜，开始加热到100℃可以使部分不溶性胶体和灰分沉降，加入浓磷酸后再用15%的石灰乳调节pH至6.0，则生成大量的磷酸钙沉淀，再加入0.8%（重量比）的活性炭于水浴中保温，既可以出去大量的胶体和灰分，又可以脱除部分生物素。此法除杂质虽然比较彻底，但同时也损失了大量的糖分。
2.2糖蜜预处理前后主要成分含量的变化
将不同预处理方法处理后的糖蜜作为碳源，调完总糖后直接上摇床，进行摇瓶发酵。在发酵过程中定时取样，测糖蜜发酵液中的OD值和残糖量。根据数据做OD值与摇瓶时间和残糖（即葡萄糖）量与摇瓶时间的关系曲线，借此考察糖蜜预处理方法对L-亮氨酸菌种生长代谢的影响。
发酵液OD值与L-亮氨酸菌种的生长代谢呈正比关系，所以从OD值的大小即可知道其菌种生长情况。在摇瓶发酵过程中，发酵液OD值即菌种生长趋势与摇瓶时间呈对数增长形式；而发酵液中糖的消耗曲线总体来说，基本上是随着菌体生长速度的增加而呈逐渐减小的趋势。
在摇瓶发酵初期，菌种消耗葡萄糖量较少，生长缓慢，导致OD值增加也较小，而发酵液中的残糖量较大，变化也较小；发酵中期，菌种开始大量消耗葡萄糖，生长很快，导致OD值急剧上升，残糖量却逐渐减小；发酵后期，菌种差不多停止生长，不再消耗葡萄糖，而OD值在达到最大值后则慢慢趋于平缓，残糖量不再发生变化。
2.3预处理后糖蜜对菌体生长与发酵产酸的影响。
在发酵培养基中分别添加经硫酸法、磷酸发、煮沸法、活性炭法、石灰法处理过的糖蜜作为碳源，糖蜜的加入量以加入发酵培养基后总糖浓度的10%计算。由表1可知，糖蜜中含有足够量的钙离子，因此在发酵培养基中不需加入CaCO3.不同糖蜜处理方法对发酵产酸的影响，结果见图1.
实验结果显示：
①硫酸法处理的糖蜜产酸量最大，为3.2g/L。
②用硫酸法处理糖蜜，不仅可使胶体物质分解，还能使蔗糖转化为菌体直接利用的单糖（含葡萄糖132%），有利于促进菌体的迅速增殖、发酵，同时也有效地抑制了其他杂菌的繁殖，此外还可以使可溶性的灰分，如亚硫酸盐或一些有机酸盐，成为不溶性的硫酸钙沉淀，并吸附部分胶体，除去杂质，也可以在此时驱除可能存在的有碍于菌体生长的亚硝酸。
③磷酸发处理的糖蜜菌体生长最好（OD值最高为0.992）。
④石灰法处理的糖蜜产酸和菌体生长都是最差的，其原因可能是糖蜜经过先加石灰乳调节pH8-pH9并在高温下加热30min后，再用硫酸中和，是一个先碱性后酸性的过程，与硫酸法刚好相反。其次，从处理后测定数据来看，钙离子含量比较高，而葡萄糖含量只有18g/L，比较低，不利于菌体的直接利用，与硫酸法对比则说明了处理糖蜜的过程中，先酸性后碱性的条件有利于发酵产酸。
3结论
在本文所试验的几种方法中，硫酸法是一种较好的糖蜜预处理方法，用硫酸法处理的糖蜜产酸量达到3.2g/L。(本文搜集整理于网络，如有侵权之处请联系我们删除）
①硫酸法处理的糖蜜产酸量最大，为3.2g/L。
②用硫酸法处理糖蜜，不仅可使胶体物质分解，还能使蔗糖转化为菌体直接利用的单糖（含葡萄糖132%），有利于促进菌体的迅速增殖、发酵，同时也有效地抑制了其他杂菌的繁殖，此外还可以使可溶性的灰分，如亚硫酸盐或一些有机酸盐，成为不溶性的硫酸钙沉淀，并吸附部分胶体，除去杂质，也可以在此时驱除可能存在的有碍于菌体生长的亚硝酸。
③磷酸发处理的糖蜜菌体生长最好（OD值最高为0.992）。
④石灰法处理的糖蜜产酸和菌体生长都是最差的，其原因可能是糖蜜经过先加石灰乳调节pH8-pH9并在高温下加热30min后，再用硫酸中和，是一个先碱性后酸性的过程，与硫酸法刚好相反。其次，从处理后测定数据来看，钙离子含量比较高，而葡萄糖含量只有18g/L，比较低，不利于菌体的直接利用，与硫酸法对比则说明了处理糖蜜的过程中，先酸性后碱性的条件有利于发酵产酸。
3结论
在本文所试验的几种方法中，硫酸法是一种较好的糖蜜预处理方法，用硫酸法处理的糖蜜产酸量达到3.2g/L。(本文搜集整理于网络，如有侵权之处请联系我们删除）