糖蜜生产单细胞蛋白的研究

    研究混菌种发酵提取蛋白饲料的最佳工艺条件，采用单因素及正交方法，以微生物含量为主要指标，考察菌种组合、菌种配比、投菌量、发酵温度、发酵浓度、发酵pH、氮源和无机盐等因素对发酵蛋白质产量的影响。试验结果表明，发酵生产蛋白的最佳发酵工艺为灭菌工艺，最佳菌种组合为白地霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母，投菌量为10 %，糖蜜最佳发酵浓度为20g/100mL，温度30℃，初始pH 5.0，投加适量酵母膏、硫酸镁、磷酸二氢钾和过磷酸钙。试验为糖蜜废液资源化利用提供了理论和试验依据

    【关键词 混合菌种 发酵条件 饲料蛋白质】
　　材料与方法
　　1 试验菌株
　　白地霉( Geotrichum candidum link) GIM2. 69; 热带假丝酵母( Candidia tropicals ) AS2. 637 ; 皮状丝孢酵母( Trichosporon cutaneum) AS2. 570; 产朊假丝酵母( Candida utilis looderet Kreger ) van Rij) AS2. 81( 由广东微生物研究所微生物菌种保藏中心提供。
　　2 实验原料
　　甘蔗糖蜜来自于广西。
　　3 实验设备
　　振荡培养箱( SPX- 150B-2 型, 上海跃进医疗器械厂) , 生化培养箱( LRH-250A 型, 广东省医疗器械厂),手提式高压灭菌器( YXQ. SG41-280A型) , 离心机( 800 型, 常州国华电器有限公司)，磁力搅拌器(HJ- 3 型, 常州国华电器有限公司) , 精密pH 计( pHS- 3C, 上海精密科学仪器有限公司) , 手持糖量计(WYTO- 80% 型, 成都泰华光学有限公司) 和生物洁净工作台( BCM-1000 型, 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)
　　4 培养基的制备
    1) 斜面培养基 麦芽汁( 稀释至10%BX)，萄糖2% , 酵母膏0.5, 琼脂2% , 自然pH,115℃
    2) 一级种子培养基成分同种子培养基, 不加琼脂, 115℃灭菌30 min。
    3) 驯化种子培养基糖蜜废液50% , pH5.0,115℃菌30min。
    4) 发酵培养基 糖蜜废液50% , 加少量氮源和磷源, 自然pH。
　　5 培养方法
　　接种量10%, 30℃在恒温振荡培养箱中140r/min, 发酵72h。
    1）过程斜面种子活化12-24h→一级种子培养24-36h→驯化种子培养48-72 h→ 摇瓶发酵培
    2）摇瓶培养条件在恒温振荡培养箱中接入混合菌种, 30℃,140r/ min进行酵母培养72 h。
    6 菌体生物量( 以细胞干质量表示) 测定方法
　　量取细胞培养液50 mL, 离心分离15 min, 转速为4000 r/min。离心后经预处理( 见图1) , 去除培养基成分, 将湿菌体置于干燥箱中, 在105 e 下烘干至恒质量, 然后称质量。

　　
    结果与分析
　　1 发酵工艺的确定
　　发酵的废糖蜜原料分为2 种, 即灭菌和不灭菌原料。在液态发酵培养基中分别接入白地霉、热带假丝酵母、皮状丝孢酵母和产朊假丝酵母, 发酵后分析其微生物含量。
　　不灭菌液态发酵工艺 废糖蜜及其他辅料混均→ 接种→发酵→分析测试。
　　灭菌液体发酵工艺 废糖蜜及其他辅料→ 混均→ 灭菌( 加热到80- 90℃维持1h)→ 接种→发酵→ 分析测试。
　　废糖蜜培养基在灭菌后经混合菌发酵产生的菌体蛋白明显高于未经灭菌的废液培养基。这可能是因为灭菌后废液培养基中, 与酵母菌有竞争关系的其他微生物被杀灭, 给存菌种的生长提供了更好的发酵环境, 也可能是因为糖蜜废液在高温环境下, 其中部分难被酵母菌利用的物质分解为易被酵母菌利用的物质, 至使产量均明显增高( 见图2)

　　2 最佳混合菌种的确定
　　在废液培养基中, 按不同组合接入白地霉、热带假丝酵母、皮状丝孢酵母和产朊假丝酵母, 菌种添加量为10 %, 各菌种间比例为1：1：1, 研究对混合菌种发酵产物中蛋白质的影响( 见图3) 。

　　在不同组合菌种中, 热带假丝酵母、白地霉和产朊假丝酵母混合发酵得到的产物微生物含量最高,这可能是由于霉菌同化淀粉和纤维素的能力强, 可将废液中的淀粉和纤维素降解为酵母能利用的单糖和双糖等简单糖类物质, 使酵母得以良好地生长繁殖, 实现生物转化蛋白饲料的效果。采用2 种或超过2 种微生物发酵, 体现了微生物间的互惠和偏利生等关系。该发酵形式对各种原料的有效转化和蛋白饲料品质的提高起到重要作用。

　　3 混合菌种最佳比例的确定
　　为确定白地霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母间的合适配比, 3 种菌按不同配比接种废液培养基
中发酵。由图4 可看出, 当白地霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母间的比例为1：1：1 时, 发酵后微生物含量最高。从发酵结果看, 若接入白地霉过多, 则发酵料有较浓的霉味, 使饲料的香味和色泽受到一定影响。若接入白地霉过少, 则分泌的纤维素分解酶和淀粉酶等酶不足, 不利于废糖蜜的分解, 分解出的葡萄糖和其他可发酵性糖过少, 导致热带假丝酵母和产朊假丝酵母的繁殖效率降低。恰当的接种比例使各微生物在发酵过程中具有良好的协同作用。

　　4 投菌量的确定
　　投菌量对实验结果有一定的影响, 故在100mL废液培养基中分别接入5%、15%、15%和20% 混合菌种, 各菌种添加比例为1：1：1, 发酵后的酵母菌产量见图5。随着接种量的增加, 酵母菌体的产量也随之增加, 用15 %和20% 接种量发酵后, 二者蛋白质含量变化不大。从经济角度和生产实践需要来看, 接入量为15% 能满足需求。

　　5 糖蜜废液最佳稀释浓度的确定
　　废糖蜜中含有约50%的可发酵性糖, 浓度过高会抑制酵母菌的生长和发酵; 浓度过低, 可发酵性糖的酵母转换率过低。因此, 应选择不同的糖蜜浓度进行发酵实验。由图6 可知, 随着糖蜜浓度的增加, 干酵母的产量逐渐增加。20 g/100 mL 时干酵母的收获量最大,25g/100 mL时培养基中的可发酵性糖浓度过高, 抑制混合菌的生长。因此, 最适发酵糖蜜浓度为
20g/100 mL。

　　6 发酵废液最佳pH 的确定
　　废糖蜜稀释后, 加酸澄清除杂, 稀糖蜜的pH 对酵母的生长没有影响。其生长最适pH 可通过实验确定。用HCl 调节发酵废液pH 后接种混合菌种。由图7 可看出, 混合菌种生长的最适pH 可通过实验。用HCI调节发酵废液pH 后接种混合菌种。
　　由图7 可看出, 混合菌种生长的最适pH 为5.0,此时废液发酵获得的干酵母最多。

　　7 菌种最佳发酵温度的确定
　　发酵温度对微生物的生长有很大的影响,温度过高或过低均不利于微生物生长。用不同的温度进行发酵实验,以确定最适培养温度,实验结果见图8。随着温度的上升,干酵母的获得量逐渐增加。当温度超过30℃时, 干酵母获得量开始下降, 因此，菌种的最适发酵温度为30℃。
　　8 无机盐的选择
　　无机盐是微生物发酵过程中的生长刺激因子,是微生物生长必不可少的营养物质, 它为机体生长提供必要的金属元素, 维持细胞的稳定性, 能调节和保持细胞的添压平衡, 可控制细胞的氧化还原电位,从而提高生物活性。适量的有效无机盐可促进微生物的快速繁殖。故在废液培养基中加入不同无机盐以研究其发酵结果。

　　由图9 可知, 硫酸镁、磷酸二氢钾和过磷酸钙的最佳添加量分别是0.3、0.3 和0.6g/ 100mL。

　　9 氮源的选择
　　氮源对微生物的生长繁殖有着重要作用, 是合成菌体中蛋白质和核酸的主要原料, 其来源有2 方面: 培养料自身的含氮物质和外界加入的含氮物质。一般来说, 外界加入的氮源对微生物的生长有更明显的作用。采用有机氮源和无机氮源进行实验, 实验因素水平见表1, 结果见表2。由表2 可看出, 影响干酵母产量的因素主次顺序是D> A> C> B, 即酵母膏> 尿素> 蛋白胨> 硝酸钠。由正交实验结果可看出, 混合发酵的最佳氮源是酵母膏。

    结  论

　　1 利用废糖蜜发酵生产单细胞蛋白的最佳菌种为白地霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母以1：1：1的比例组合, 投菌量为10%, 在20g/100mL 的糖蜜废液中, 分别加硫酸镁、磷酸二氢钾和过磷酸钙至0.3、0.3 和0.6 /100 mL,调节pH 为5.0, 在30℃下发酵72 h, 经干燥处理, 可获得酵母干菌体。
　　2 废糖蜜是制糖工业的主要废弃物, 经稀释、酸化、澄清和加营养盐后, 在最适发酵条件下生产单细胞蛋白, 具有很好的经济效益和社会效益, 并具有很好的发展前景。（本文搜集整理于网络，如有侵权之处，请联系我们删除。）